Thèse Optimisation de l'Apomixie Synthétique chez le Riz par des Approches d'Édition du Génome H/F - 34

Établissement : Université de Montpellier
École doctorale : GAIA - Biodiversité, Agriculture, Alimentation, Environnement, Terre, Eau
Laboratoire de recherche : AGAP Institut, Amélioration Génétique et Adaptation des Plantes
Direction de la thèse : Hugues DE VERDAL ORCID 0000000219238575
Début de la thèse : 2026-11-02
Date limite de candidature : 2026-05-07T23:59:59

L'exploitation de l'hétérosis représente un atout stratégique pour améliorer les rendements, la stabilité et la résilience des cultures. Toutefois, chez le riz, espèce autogame, la production de semences hybrides est coûteuse et la vigueur hybride ne peut être maintenue lors de la replantation, en raison de la ségrégation génétique. Dans ce cadre, l'introduction d'une apomixie synthétique, permettant une reproduction clonale par graines, représente une stratégie innovante pour fixer durablement les performances hybrides. Des avancées récentes ont permis d'obtenir chez le riz un système d'apomixie synthétique combinant une apoméiose artificielle (via l'inactivation de trois gènes méiotiques clés) avec un déclenchement de la parthénogenèse par l'expression ectopique dans la cellule oeuf du facteur de transcription de l'embryogenèse zygotique OsBBM1. Bien que ce système permette d'atteindre des taux élevés de descendance clonale, il reste limité par une baisse de fertilité importante et par la présence d'ADN transgénique intégré, non éliminable en l'absence de reproduction sexuée. Le sujet de thèse proposé vise à optimiser le système d'apomixie synthétique chez le riz selon deux axes complémentaires, fondés sur des approches d'édition du génome de précision. Le premier axe consiste à moduler finement l'expression endogène de OsBBM1 dans la cellule oeuf, par la caractérisation et l'édition ciblée de ses régions régulatrices. L'objectif est d'obtenir une activation précoce mais contrôlée, compatible avec la fécondation de la cellule centrale et le développement normal de l'albumen, afin d'améliorer la fertilité des lignées apomictiques. Cette approche s'appuiera sur des analyses fonctionnelles de promoteurs, des approches multi-omiques sur cellules isolées (transcriptomique et accessibilité de la chromatine) et des stratégies d'édition du génome qui seront adaptées en fonction des régions candidates identifiées. Le second axe vise à développer une stratégie pour éliminer les séquences d'ADN-T devenues superflues après l'obtention des modifications des gènes méiotiques cibles (cassettes d'édition et de sélection). En exploitant l'expression constitutive de la Cas9 dans les lignées apomictiques, des stratégies d'excision ciblée seront développées afin de supprimer ces séquences tout en conservant l'intégrité de la cassette parthénogénétique. Un système « preuve de concept », basé sur l'utilisation d'un gène rapporteur GFP sera d'abord mis en place afin d'évaluer l'efficacité et la précision de l'excision, avant le développement d'une construction intragénique « tout-en-un » permettant l'auto-excision des éléments d'édition après leur fonction. À plus long terme, les axes 1 et 2 pourraient converger vers la mise au point d'une construction incorporant les guides ARN ciblant les régions régulatrices de OsBBM1 dans la cassette d'édition finale afin de développer un système d'apomixie synthétique reposant exclusivement sur une machinerie d'édition du génome qui pourra par la suite être éliminée par excision. À l'issue du projet, ce travail vise à lever des verrous majeurs limitant l'apomixie synthétique chez le riz, en améliorant la fertilité du système et en rendant le système compatible avec les exigences réglementaires associées aux plantes NGT. Ces avancées ouvriront la voie à une évaluation en conditions agronomiques et rapprocheront l'apomixie synthétique d'un déploiement au champ. Ce projet participe à l'émergence de systèmes de reproduction innovants, susceptibles de faciliter l'accès aux variétés hybrides et de soutenir une agriculture plus durable et résiliente.

L'exploitation de l'hétérosis représente un levier efficace pour accroître les rendements, la stabilité des performances et la résilience des cultures1. Chez les espèces cultivées autogames comme le riz, la production de semences hybrides reste toutefois coûteuse et techniquement contraignante2, limitant l'accès à ces innovations, en particulier pour les exploitations agricoles familiales. De plus, la replantation des semences hybrides entraîne une perte de l'uniformité génétique et de l'hétérosis, conséquence du brassage des caractères parentaux, obligeant les agriculteurs à racheter des semences à chaque saison. Dans ce contexte, l'introduction de l'apomixie, un mode de reproduction clonale par graines, chez les plantes cultivées apparaît comme une perspective prometteuse afin de reproduire fidèlement les performances hybrides d'une génération à l'autre3. Cependant, malgré des recherches approfondies, aucune source naturelle d'apomixie n'a été identifiée chez le riz ni chez ses apparentés. Une alternative consiste donc à concevoir une apomixie synthétique par ingénierie génétique4,5.
La reproduction artificielle de l'apomixie dite gamétophytique diplosporée repose sur trois étapes clés : (i) la conversion de la méiose en mitose (apoméiose), permettant la formation de gamètes diploïdes non réduits et non recombinés ; (ii) le déclenchement du développement parthénogénétique de la cellule oeuf diploïde en embryon ; (iii) le développement de l'albumen, soit par fécondation de la cellule centrale (pseudogamie), soit de manière autonome à partir de la cellule centrale non fécondée6. Le transfert au riz d'une approche développée chez Arabidopsis, reposant sur l'inactivation simultanée de trois gènes clés différenciant la méiose de la mitose, a conduit à l'obtention du triple mutant MiMe (Mitosis Instead of Meiosis), produisant des gamètes diploïdes non recombinés7,8. La combinaison de MiMe avec l'expression spécifique dans la cellule oeuf du facteur de transcription embryogénique BABY BOOM1 du riz (OsBBM1) a permis d'obtenir jusqu'à 29% de descendance clonale, constituant la première démonstration d'une apomixie synthétique chez les plantes cultivées9. Par la suite, une avancée majeure a été réalisée grâce à l'introduction d'un ADN de transfert (ADN-T) unique dans du riz hybride, permettant à la fois l'inactivation des gènes MiMe et l'induction de la parthénogenèse via l'expression ectopique de OsBBM1. Ce système, qui demeure à ce jour le plus efficace, a conduit à obtenir plus de 95% de graines clonales. Ce caractère s'est révélé stable sur plusieurs générations en serre et a permis la reproduction fidèle de l'hybride10.
Malgré ce fort potentiel, les systèmes d'apomixie synthétique actuels sont fortement impactés par une baisse de fertilité, freinant leur déploiement à grande échelle11. Des observations récentes, réalisées dans le laboratoire d'accueil, indiquent que la fertilité réduite ne résulte pas d'une altération de la viabilité des gamétophytes, mais semble liée à un déclenchement insuffisamment contrôlé de la parthénogenèse. En effet, l'analyse du développement embryonnaire a montré que, dans les événements hautement apomictique, l'activation de OsBBM1 conduit à la formation d'embryons parthénogénétiques de grande taille avant l'anthèse, ce qui pourrait compromettre la fécondation de la cellule centrale et le développement de l'albumen. À l'inverse, des événements modérément pénétrants, mais pleinement fertiles, présentent des embryons parthénogénétiques plus petits, suggérant qu'un ajustement fin de l'accumulation de OsBBM1 dans la cellule oeuf est un déterminant majeur du fonctionnement du système, pour concilier parthénogenèse et fertilité. De plus, les systèmes actuels restent dépendants de l'insertion d'ADN transgénique (ADN-T), avec l'impossibilité de faire ségréger les éléments non nécessaires après édition du génome, incluant les cassettes de sélection et d'édition, en raison de l'absence de reproduction sexuée, pouvant constituer un frein important à l'acceptabilité et à la diffusion de la technologie.

L'objectif de cette thèse est d'optimiser, par des approches d'édition génomique de précision, le système d'apomixie synthétique chez le riz afin de générer des lignées apomictiques fertiles, stables et ne conservant qu'une quantité strictement limitée d'ADN exogène. Le projet vise à obtenir une activation précise et finement contrôlée du facteur naturel de l'embryogenèse zygotique OsBBM1 dans la cellule oeuf, par l'identification et la modification ciblée de ses régions régulatrices, afin d'induire une parthénogenèse homogène compatible avec le développement de l'albumen et le maintien de la fertilité. En parallèle, une stratégie innovante sera mise en oeuvre pour éliminer les séquences d'ADN-T devenues superflues après modification des gènes cibles. À terme, ce travail contribuera à lever des verrous majeurs de l'apomixie synthétique et à rapprocher cette technologie d'une application agronomique.

La thèse s'articulera autour de deux axes principaux, reposant sur des stratégies de biologie moléculaire et d'édition du génome. Le premier axe vise à identifier et éditer les régions régulatrices endogènes du gène OsBBM1 afin de permettre une activation spécifique et contrôlée dans la cellule oeuf, après la formation du sac embryonnaire mais avant la fécondation. Ce contrôle précis devrait permettre un déclenchement de l'embryogenèse parthénogénétique compatible avec la fécondation de la cellule centrale, permettant ainsi d'obtenir une fertilité accrue du système d'apomixie synthétique. Le second axe portera sur l'élimination des séquences d'ADN-T superflu issu des constructions d'édition génétique utilisées pour induire l'apoméiose. En exploitant l'expression constitutive de la Cas9 dans les lignées apomictiques, des stratégies innovantes d'excision ciblée seront développées afin de supprimer les séquences non désirées, notamment les gènes de sélection et la machinerie d'édition, après obtention des modifications génétiques souhaitées.

Axe 1: Modulation de l'expression de OsBBM1 par édition des régions régulatrices. Cet axe repose sur une meilleure compréhension de la régulation de OsBBM1 et une caractérisation approfondie des mécanismes transcriptionnels et épigénétiques contrôlant sa répression avant la fécondation. Chez les plantes sauvages, l'allèle maternel de OsBBM1 demeure réprimé dans la cellule oeuf jusqu'à la fécondation9. L'allèle paternel est exprimé dans les cellules spermatiques et déclenche l'embryogenèse zygotique après la fécondation, tout en levant la répression de l'allèle maternel. Les principaux facteurs connus responsables de la répression de OsBBM1 dans la cellule oeuf sont des composants du complexe Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2)12.

L'identification des régions candidates impliquées dans la répression ou l'activation endogène du gène OsBBM1 s'appuiera sur trois approches complémentaires :
(i) Une analyse de lignées transgéniques développées par le partenaire UC Davis (USA), comprenant d'une part, une série de délétions séquentielles des régions promotrices de OsBBM1 fusionnées transcriptionnellement au gène rapporteur GFP, et d'autre part, des constructions dans lesquelles les motifs GAGA situés dans la région en amont du codon ATG, impliqués dans le recrutement du complexe PRC2, ont été mutés. Un microscope biphoton, associé à un protocole d'observation optimisé, sera utilisée pour analyser l'expression de la GFP avant la floraison dans les ovules en développement, afin de détecter toute expression ectopique depuis la formation du sac embryonnaire jusqu'à l'anthèse ;
(ii) Des analyses bio-informatiques à partir de bases de données publiques et internes, réalisées en collaboration avec le partenaire IPS2, intégrant conservation de séquence, profils de méthylation de l'ADN, accessibilité de la chromatine, modifications d'histones et prédiction de sites de fixation de facteurs de transcription, afin d'identifier des éléments régulateurs de OsBBM1, conservés entre différentes ressources génétiques et donc putativement des candidats intéressants à éditer ;
(iii) Des analyses sur cellule individuelle, réalisées en collaboration avec le partenaire IPS2, combinant transcriptomique (RNA-seq) et accessibilité de la chromatine (ATAC-seq) dans les cellules oeufs et embryons précoces, permettant d'associer l'activité transcriptionnelle aux paysages régulateurs dans des contextes cellulaires spécifiques, en donnant simultanément accès aux éléments cis-régulateurs et aux niveaux d'expression des facteurs de transcription susceptibles de s'y lier13,14. Pour réaliser ces analyses, des ovules seront disséqués au stade de développement approprié au sein du laboratoire d'accueil, puis les expérimentations de RNA-seq et d'ATAC-seq seront conduites par le partenaire IPS2, avec la possibilité pour le/la doctorant(e) d'effectuer des séjours sur site afin de participer aux manipulations et aux analyses associées.

Dans un second temps, les régions régulatrices de OsBBM1 identifiées comme critiques pour sa répression ou son activation seront ciblées par des approches d'édition du génome afin de déclencher son accumulation dans la cellule oeuf au moment opportun. Selon la nature des modifications à apporter, la méthode d'édition la plus appropriée sera appliquée pour supprimer, modifier ou remplacer des motifs, respectivement par édition du génome, prime editing ou remplacement ciblé.

Axe2 : Élimination ciblée des séquences d'ADN-T superflues par édition du génome. Cet axe vise à développer un riz apomictique intragénique par excision ciblée des séquences non désirées intégrées avec l'ADN-T initial (ADN superflu). Pour cela, il est proposé de tirer parti de l'expression continue de la Cas9 déjà présente dans les lignées apomictiques pour induire, via l'expression appropriée d'un ARN guide d'excision (egRNA), la délétion précise des segments superflus encadrés par des sites cibles.

Dans le but d'évaluer l'efficacité du système d'excision une nouvelle construction génétique « preuve-du-concept » sera développée et introduite de manière stable chez le riz. Cette construction contiendra des sites cibles artificiels pour l'egRNA encadrant l'ADN-T superflu, ainsi qu'un système rapporteur GFP, avec un promoteur constitutif d'une part et le gène rapporteur de l'autre. L'efficacité de l'excision sera testée par reconstruction de la fusion promoteur:rapporteur après introduction l'egRNA, en suivant l'activité de GFP, puis validée par des analyses moléculaires. Avant le début de la thèse, une évaluation préalable permettra de définir le couple egRNA/cible optimal, à partir de lignées disponibles portant les cibles artificielles intégrées en une seule copie et réparties à différentes positions connues dans le génome du riz. Différentes modalités d'expression de l'egRNA seront comparées, par transformation génétique stable ou transitoire de la lignée « preuve-du-concept », afin d'optimiser la précision et le contrôle temporel de l'excision. Dans un premier temps, l'egRNA sous contrôle du promoteur PolIII U6 sera testée pour déterminer la fonctionnalité, l'efficacité de la reconstruction et la précision de l'excision. Par la suite, deux autres stratégies de transcription seront évaluées, basée sur l'utilisation d'un egRNA flanqué de ribozymes15 et contrôlé par deux promoteurs PolII différents, visant à permettre la suppression de l'ADN-T superflu après obtention des mutations MiMe, de manière inductible par la chaleur ou spécifique d'un tissu16,17.
Sur la base du système de transcription de l'egRNA le plus performant, une construction finale intragénique « tout-en-un » sera développée, dans laquelle les éléments nécessaires à l'excision seront eux-mêmes éliminés après avoir rempli leur fonction. Les lignées obtenues seront caractérisées au niveau moléculaire et fonctionnel afin de vérifier l'intégrité de la cassette parthénogénétique, la stabilité du phénotype apomictique, ainsi que la fertilité des plantes. Dans l'éventualité où les régions régulatrices de OsBBM1 seraient identifiées lors de la première année de thèse, il sera également envisageable d'inclure les guides ARN correspondant dans la cassette d'édition de la construction génétique finale, afin de créer un système d'apomixie synthétique entièrement dépendant de l'édition des génomes. Cette option représente toutefois une perspective globale du projet et pourrait ne pas être intégrée dans la temporalité de la thèse.