Thèse Dynamique de la Protéine Hir3 dans des Nanodomaines du Tonoplaste et Rôle dans l'Immunité des Plantes H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université de Montpellier École doctorale : GAIA - Biodiversité, Agriculture, Alimentation, Environnement, Terre, Eau Laboratoire de recherche : IPSiM - Institut des Sciences des Plantes de Montpellier Direction de la thèse : Enric ZELAZNY ORCID 0000000247931510 Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-05-07T23:59:59 Les membranes biologiques sont organisées en nanodomaines, des assemblages nanométriques de protéines et de lipides jouant un rôle de plateforme de régulation impliquée dans différents processus biologiques, notamment les réponses immunitaires. Les protéines à domaine SPFH s'organisent en nanodomaines et peuvent avoir des fonctions de 'scaffolding' dans les membranes. Chez Arabidopsis, les protéines à domaine SPFH appelées HIRs, notamment l'isoforme HIR3, sont impliquées dans la défense contre les pathogènes, bien que les mécanismes moléculaires sous-jacents demeurent inconnus. De façon intéressante, nos analyses récentes montrent que HIR3 s'organise en nanodomaines très dynamique dans le tonoplaste des cellules d'Arabidopsis, un phénomène jusqu'à présent non décrit chez les plantes. Il est important de noter que le tonoplaste a une fonction importante dans la défense des cellules végétales. L'hypothèse centrale de ce projet est que HIR3 pourrait agir comme une protéine de 'scaffolding' régulant des protéines tonoplastiques liées à l'immunité. Deux objectifs principaux seront poursuivis durant la thèse :
1) Étudier la dynamique et l'organisation de HIR3 dans des nanodomaines du tonoplaste, en analysant l'impact de stimuli biotiques et de l'environnement lipidique.
2) Comprendre le rôle de HIR3 dans l'immunité, via des tests de pathogénicité, l'étude de la fermeture stomatique chez des mutants hir3 et l'identification de partenaires protéiques potentiellement régulés par HIR3.
L'ensemble de ce projet devrait permettre de comprendre comment HIR3 s'organise dans les nanodomaines du tonoplaste et régule des acteurs de l'immunité végétale.
Les membranes biologiques sont sous-compartimentées en une multitude de nanodomaines correspondant à des assemblages locaux de protéines et de lipides de taille nanométrique (
La superfamille de protéines Stomatine/Prohibitine/Flotilline/HflK/C (SPFH) est une famille très diversifiée de protéines procaryotes et eucaryotes qui s'organisent en nanodomaines membranaires (Stoner et al., 2025). Les plantes possèdent un groupe spécifique de protéines SPFH appelé 'Hypersensitive Induced Reaction' (HIR) et composé de quatre membres chez Arabidopsis thaliana (HIR1-HIR4). A l'exception de HIR3 localisée sur le tonoplaste, toutes les autres isoformes HIR d'Arabidopsis sont situées dans la membrane plasmique (Danek et al., 2020). Jusqu'à présent, l'organisation de protéines dans des nanodomaines du tonoplaste n'avait jamais été décrite chez les plantes. Cependant, nos résultats récents suggèrent que HIR3 forme des nanodomaines extrêmement dynamiques dans le tonoplaste des cellules d'Arabidopsis, comme visualisé par microscopie 'Total Internal Reflection Fluorescence' (TIRF). Cette observation ouvre des perspectives très intéressantes en termes de fonctions des nanodomaines chez les plantes. Les protéines HIR sont impliquées dans l'immunité des plantes, bien que les mécanismes moléculaires sous-jacents restent énigmatiques (Qi et al., 2011; Liu et al., 2024). Une hypothèse est que les HIRs pourraient agir comme des protéines de 'scaffolding', permettant de réguler la fonction de protéines liées à l'immunité, ceci au sein des nanodomaines (Hdedeh et al., 2025). Cette hypothèse est étayée par nos récent travaux montrant que la protéine HIR2 peut réguler certains canaux de la membrane plasmique (Hdedeh et al., en préparation). Chez Arabidopsis, HIR3 est impliquée dans la défense contre la bactérie pathogène Pseudomonas siringae (Liu et al., 2024). Des travaux en cours, en collaboration avec le Laboratoire des Interactions Plantes-Microbes-Environnement (LIPME) de Toulouse (projet ANR HIRAQIM), visent à déterminer si HIR3 joue également un rôle dans la défense contre d'autres bactéries pathogènes comme Xanthomonas campestris. Bien que le tonoplaste et la vacuole soient connus pour jouer un rôle important dans l'immunité des plantes (Madina et al., 2019; Hilleary et al., 2020), les processus mis en jeu restent peu étudiés. Notre hypothèse principale est que HIR3 pourrait avoir une fonction de 'scaffolding' lui permettant de réguler certaines protéines tonoplastiques de défense.
Deux objectifs principaux seront poursuivis durant la thèse :

1) Etudier la dynamique de la protéine HIR3 et son organisation en nanodomaines dans le tonoplaste des cellules d'Arabidopsis en utilisant des techniques de microscopie de pointe. Notamment, le ou la doctorante(e) analysera l'impact de stimuli biotiques et de l'environnement lipidique sur la dynamique intracellulaire de HIR3.

2) Comprendre la fonction de HIR3 dans l'immunité chez Arabidopsis. Dans le cadre d'une collaboration avec le Laboratoire des Interactions Plantes-Microbes-Environnement (LIPME) de Toulouse, des tests de pathogénicités avec différentes souches bactériennes seront réalisés. Nous étudierons également un rôle potentiel de HIR3 dans la fermeture stomatique en réponse aux pathogènes. Enfin, dans le but d'identifier des protéines potentiellement régulées par HIR3 et liées à l'immunité, nous réaliserons un interactome de HIR3. Les caractérisations moléculaires et phénotypiques nécessaires pour comprendre l'importance de ces interactions seront ensuite réalisées.
1) Nous analyserons la dynamique de la protéine HIR3 et son organisation en nanodomaines dans le tonoplaste.
Premièrement, nous comparerons la mobilité latérale des nanodomaines contenant HIR3 avec celle des nanodomaines HIR2 de la membrane plasmique. En effet, nous suspectons que les nanodomaines du tonoplaste sont extrêmement mobiles. D'autres paramètres tels que la taille et la densité des nanodomaines seront également comparés (Jarsch et al., 2014).
Deuxièmement, nous étudierons l'impact de stimuli biotiques sur la dynamique intracellulaire de HIR3. En effet, l'organisation en nanodomaines des protéines peut être régulée par des stimuli environnementaux (Smokvarska et al., 2020). En pratique, nous mimerons une attaque bactérienne en utilisant le peptide bactérien flg22 et analyserons l'impact sur la dynamique intracellulaire de HIR3. Pour les deux premiers axes de recherche présentés ci-dessus, la microscopie TIRF et/ou la microscopie à super-résolution 'single-particle-tracking photoactivated localization microscopy' (sptPALM), qui sont maîtrisées au laboratoire, seront utilisées. Des lignées transgéniques d'Arabidopsis exprimant les protéines de fusion HIR3-GFP/mCherry sont déjà disponibles dans l'équipe. Pour les approches de microscopie à super-résolution, des fusions HIR3-mEOS3 seront générées.
Troisièmement, des résultats obtenus dans l'équipe montrant que l'organisation en nanodomaines de la protéine HIR2 dépend de la composition lipidique des membranes (Danek et al., 2025), nous étudierons l'importance des lipides du tonoplaste dans la dynamique de HIR3. Dans un premier temps, nous identifierons les lipides présents dans les nanodomaines HIR3 en utilisant la technique des nanodisques qui permet de générer des disques membranaires de très petite taille (~ 50-100 nm) (Hurst et al., 2023). Après avoir généré des nanodisques en traitant des tissus végétaux exprimant la protéine HIR3-GFP avec un agent chimique appelé copolymère, les nanodisques contenant HIR3-GFP seront immunopurifiés et les lipides co-purifiés seront identifiés par des techniques de lipidomique. Il est important de noter que la technique des nanodisques est maîtrisée au laboratoire et que les analyses de lipidomique seront réalisées en collaboration avec le Laboratoire de Biogénèse Membranaire (LBM) de Bordeaux. Dans un second temps, le rôle des lipides identifiés dans la dynamique de HIR3-GFP sera analysé. Pour cela, des drogues perturbant spécifiquement ces lipides ou des mutants d'Arabidopsis affectés dans la biosynthèse de ces lipides seront utilisés.

2) Nous chercherons à comprendre la fonction de HIR3 dans l'immunité chez Arabidopsis.
Comme évoqué ci-dessus, la sensibilité à X. campestris de mutants hir3 d'Arabidopsis générés au laboratoire par la technique CRISPR/Cas9 est actuellement analysée au LIPME. Le(a) doctorant(e) participera à la poursuite de ces tests via des techniques précédemment décrites (Luneau et al., 2022). Pour compléter ces résultats, des mutants hir3 complémentés via l'expression de HIR3-GFP ainsi que des lignées transgéniques sur-exprimant HIR3 sont en cours d'obtention. Nous avons récemment mis en évidence un rôle de HIR2 dans la fermeture stomatique en réponse à flg22, ce qui constitue un mécanisme de protection pour la plante (Amo, Hdedeh et al., en préparation). Dans le cadre de cette thèse, le(a) doctorant(e) déterminera si les mutants hir3 sont affectés dans le fermeture stomatique en réponse à flg22.
Une hypothèse est que HIR3 pourrait jouer un rôle de 'scaffolding' lui permettant de recruter des protéines nécessaires à la défense de la plante dans des nanodomaines du tonoplaste et d'assurer leur régulation. Afin d'identifier des protéines potentiellement régulées par HIR3, nous réaliserons un interactome de HIR3 en immunopurifiant HIR3-GFP exprimée chez Arabidopsis puis en identifiant les protéines co-purifiées par spectrométrie de masse, ceci en présence ou en absence de stimulus biotique tel que le peptide bactérien flg22. Cette approche pourrait permettre d'identifier des protéines tonoplastiques déjà connues pour être impliquées dans l'immunité mais également de nouveaux acteurs. Par la suite, nous entreprendrons les caractérisations moléculaires et phénotypiques nécessaires pour comprendre l'importance de ces interactions HIR3-protéines candidates. Notamment nous : (i) validerons les interactions HIR3-protéines candidates par différentes approches (co-IP, BiFC, FRET-FLIM...), (ii) déterminerons si la localisation des protéines candidates est perturbée chez les mutants hir3, (iii) analyserons le phénotype des mutants candidats d'Arabidopsis en lien avec la réponse aux pathogènes (P. siringae, X. campestris).

Le ou la candidat(e) doit détenir un Master 2 et posséder une formation en biologie végétale et/ou biologie cellulaire. Il ou elle doit en outre être très intéressé(e) par la recherche scientifique.