Thèse Decrypter l'Invisible Nouvelle Approche Analytique des Tanins par Spectrometrie de Masse a Mobilite Ionique H/F - Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Institut Agro Montpellier École doctorale : GAIA - Biodiversité, Agriculture, Alimentation, Environnement, Terre, Eau Laboratoire de recherche : SPO - Sciences Pour l'Oenologie Direction de la thèse : Laetitia MOULS ORCID 0000000278619685 Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-05-07T23:59:59 Les tanins sont omniprésents dans notre quotidien : vins, bois, aliments, cosmétiques... Pourtant, leur évolution et leurs mécanismes d'oxydation demeurent encore largement méconnus. Ce projet de thèse propose une approche analytique de rupture pour lever ces verrous, en s'appuyant sur la spectrométrie de masse couplée à la mobilité ionique, ouvrant ainsi la voie à des applications innovantes en oenologie, en foresterie et plus largement dans la valorisation des biomolécules végétales.Des travaux menés au sein de l'UMR SPO ont permis la constitution d'une base de données originale de marqueurs d'oxydation des tanins naturellement formés au cours des procédés de transformation et de conservation. Toutefois, la caractérisation de la « face cachée » des tanins (en particulier des fractions polymériques oxydées) constitue encore un verrou analytique majeur. La compréhension des mécanismes et des paramètres régissant leur oxydation, ainsi que l'identification structurale des produits formés, représentent un enjeu scientifique et industriel important, notamment pour une meilleure maîtrise des procédés et une valorisation accrue des sous-produits.

Afin de lever ce verrou, ce projet, mené en collaboration entre les UMR SPO et IATE, s'articule autour de deux axes complémentaires fondés sur des approches innovantes en spectrométrie de masse.

Le premier axe, méthodologique, vise à développer une stratégie analytique de rupture reposant sur la spectrométrie de masse à mobilité ionique pour déterminer l'état d'oxydation de la fraction tannique des échantillons. Cette approche constitue une alternative aux méthodes actuelles de dépolymérisation chimique, souvent lourdes et difficilement transposables à l'échelle industrielle. L'objectif est d'évaluer l'état d'oxydation des tanins sans étape préalable de dépolymérisation, grâce à une modulation contrôlée des tensions en source et/ou dans la cellule de mobilité, permettant d'explorer les propriétés structurales et conformationnelles des espèces analysées.

Le second axe, plus fondamental, ambitionne d'élucider de manière approfondie la structure des marqueurs d'oxydation identifiés, en exploitant les capacités séparatives et structurales de la mobilité ionique couplée à la spectrométrie de masse. Ces travaux permettront d'intégrer ces connaissances dans l'étude de matrices complexes et de mieux comprendre l'évolution des tanins au sein des systèmes naturels et transformés. Les tanins condensés, polymères de flavanols, jouent un rôle important dans les mécanismes de défense des plantes ; ils sont synthétisés en réponse à des stress biotiques ou abiotiques. Ils contribuent également à la survie/pérennité des espèces en protégeant les graines ou les feuilles contre les ravageurs. L'oxydation des tanins condensés est une stratégie développée par les plantes pour les protéger des pathogènes ou du stress oxydant (photooxydation, piégeage des radicaux libres). Par conséquent, les tanins extraits à partir de divers organes ou tissus des plantes peuvent être naturellement oxydés, à un degré dépendant des stress auxquels ils ont été exposés. Leur grande aptitude à s'oxyder constitue par ailleurs un point de vigilance particulier dès la récolte des fruits jusqu'à leur consommation car cela affecte les qualités organoleptiques des produits. D'un point de vue chimique, les tanins sont des polymères hétérogènes qui varient individuellement par le nombre et la diversité des unités qui les constituent, le type et la nature des liaisons qui les relient, mais également du fait de leur réactivité chimique, l'oxydation complexifiant leur structure de base. Il en résulte une vraie difficulté à les analyser et à caractériser finement les motifs oxydés. Bien qu'une réaction de dépolymérisation chimique permette de libérer les unités originelles constitutives des polymères de tanins, la fraction des unités oxydées résiste aux conditions de la réaction et reste inaccessible à l'analyse UHPLC-DAD-MS du fait de son hétérogénéité. En général, elle apparaît, dans le chromatogramme, comme un large pic étendu sous les pics des unités dépolymérisées : la « bosse ». Des estimations basées sur l'intégration du signal UV de cette « bosse » suggèrent que la fraction oxydée pourrait représenter de 20 à 80% du poids total de la fraction de tanins. Tout l'enjeu serait de mieux caractériser cette fraction avec des critères comme le degré d'oxydation des motifs oxydés, le nombre de motifs reliant des bouts de chaîne versus extension, ainsi que le nombre de motifs résultant d'oxydation intra-chaînes versus inter-chaînes, qui indiquerait le degré de rigidité (compactage) versus le degré de ramification. Ces indicateurs permettraient d'améliorer la vision globale de la structure des tanins et envisager de meilleures stratégies de valorisation dans le cas des extraits (rafles, marcs...).
Actuellement, des travaux menés au laboratoire SPO ont permis la construction d'une base de données unique de marqueurs d'oxydation des tanins naturellement générés durant la transformation et le stockage des produits [1, 2]. Après dépolymérisation chimique des tanins, les données recueillies après les analyses UHPLC-MS2 sont actuellement pré-traitées et pré-validées manuellement, rendant l'opération chronophage et difficilement exploitable au niveau industriel, pour alimenter ensuite la constitution de réseaux de similarités spectrales (réseaux moléculaires) [3].
Au travers de ce projet de thèse, nous nous proposons de développer une approche innovante disruptive d'analyse par spectrométrie de masse à mobilité ionique, permettant d'étudier et de caractériser l'état d'oxydation des tanins, sans dépolymérisation chimique.
La réaction de dépolymérisation chimique utilisée jusqu'ici pour analyser et caractériser les tanins fait intervenir un agent nucléophile pour piéger, après rupture des liaisons inter-monomériques, les unités d'extension libérées sous forme de carbocations. Différents agents nucléophiles ont été utilisés pour dépolymériser les tanins condensés et ont donné leur nom à la méthode : thioglycolyse (réaction avec l'acide thioglycolique), phloroglucinolyse (réaction avec le phloroglucinol), furanolyse (avec le menthofurane), etc. La durée de la réaction, la température à laquelle elle est réalisée, la neutralisation ou non du milieu après réaction et le temps au bout duquel l'analyse est réalisée sont autant de variantes qui peuvent influencer les résultats obtenus.
Par conséquent, la possibilité de provoquer la dépolymérisation des tanins au sein de l'instrument d'analyse offre un grand avantage. De plus, cette réaction s'y prête particulièrement dans la mesure où elle génère des carbocations (ions chargés positivement) qui peuvent être directement détectés par le spectromètre de masse. Cette approche a été développée avec succès par l'équipe de J.P. Salminen (Univ. Turku, Finlande)[4]. Toutefois, dans les travaux de cette équipe, l'analyse de l'oxydation est réalisée au travers de l'évaluation du rapport entre unités di-hydroxylées et tri-hydroxylées, ces dernières étant les seuls marqueurs de l'oxydation considérés. Or, les travaux réalisés par SPO ont montré une très grande diversité des marqueurs d'oxydation, qui se caractérisent par des motifs dimériques, trimériques, avec différents degrés d'oxydation. La Plateforme Polyphénols a été récemment dotée de deux spectromètres de masse à très haute résolution qui sont considérés aujourd'hui parmi les instruments les plus performants, notamment pour développer des approches métabolomiques. Le travail réalisé sur le TIMS-TOF et les connaissances déjà acquises sur les motifs oxydés des tanins après dépolymérisation chimique ont motivé notre envie d'aller encore plus loin dans la caractérisation de l'état d'oxydation des tanins tout en simplifiant la méthodologie en amont de l'analyse. En effet, il est envisagé de provoquer la réaction de dépolymérisation en appliquant des tensions à l'entrée du spectromètre de masse (source) ou/et dans la cellule de mobilité ionique. L'augmentation des tensions favorise les réactions de fragmentation des ions. Celles des tanins sont bien documentées et parmi elles, celle conduisant à la rupture de la liaison inter-monomérique. Dans le cadre de la thèse, il s'agira de réaliser une étude approfondie de l'impact des tensions en source et/ou dans la cellule de mobilité ionique sur la fragmentation des tanins oxydés, l'objectif étant de parvenir à fragmenter les liaisons natives des tanins condensés tout en préservant les liaisons issues de l'oxydation.
La cellule de mobilité ionique offre une dimension supplémentaire de séparation des ions co-élués en sortie de chromatographie (et éventuellement fragmentés en source), sur des critères liés à la surface exposée au gaz à contre-courant (taille et forme des ions en phase gazeuse). Cette surface efficace de collision, la CCS (Collision Cross Section) est une propriété physique intrinsèque des ions et apporte une donnée supplémentaire pour l'identification ou la classification des ions. La cellule de mobilité ionique est réputée performante pour la séparation des isomères, ce qui permet de supposer qu'elle devrait bien s'appliquer à la séparation des ions correspondant aux motifs oxydés, qui sont le plus souvent des isomères de position (régioisomères) et se distinguent par leur géométrie et leur forme. Ainsi, cette méthode a le potentiel d'identifier d'autres marqueurs d'oxydation isomériques qui n'ont pas encore été détectés par les méthodes UHPLC-MS sans recours à la mobilité ionique. En outre, l'instrument est équipé d'un logiciel de retraitement des données qui intègre de la modélisation de structures et fait de la prédiction de valeur du facteur de séparation des ions (CCS).

Ce projet répond à différents enjeux :
Enjeux scientifiques :
- Accéder à l'analyse à large échelle de l'état d'oxydation des tanins grâce au développement d'une nouvelle approche analytique de rupture par spectrométrie de masse à mobilité ionique.
- Compréhension des mécanismes et des paramètres qui régissent l'oxydation des tanins.
- Caractérisation fine de la fraction tannique permettant de valoriser les sous-produits/co-produits : une meilleure caractérisation de la fraction oxydée permettra une meilleure compréhension des structures des tanins et par conséquent d'envisager la meilleure stratégie de valorisation. En effet, les unités dépolymérisables pourront être isolées des motifs oxydés (oligomères, principalement dimères et trimères) et suivre des voies de valorisation indépendantes. Les premiers pourront servir de molécules plateformes ou de synthons biosourcés pour des applications en chimie de spécialité. Les propriétés biologiques et physico-chimiques des seconds devront être évaluées pour envisager de nouvelles applications.
Enjeux socio-économiques : Ecoconception, utilisation des ressources renouvelables : meilleur ciblage des matières premières à partir desquelles sont extraits les tanins, et meilleure stratégie de valorisation. Critère d'évaluation de la qualité des extraits commercialisés pour les ingrédientistes ou les formulateurs.
Ce projet de thèse a pour objectifs de :
1- Développer une nouvelle approche d'analyse des tanins sans dépolymérisation chimique : Accéder à l'analyse à large échelle de l'état d'oxydation des tanins grâce au développement d'une nouvelle approche analytique de rupture innovante par spectrométrie de masse de mobilité ionique (tims-MS).
2- Comprendre les mécanismes d'oxydation et identifier de nouveaux marqueurs : Caractériser finement de la fraction tannique
3- Permettre une meilleure valorisation des sous-produits/co-produits contenant des tanins dans différents secteurs (vin, bois...). Une meilleure connaissance de leurs structures, notamment au regard de l'oxydation, est un pré-requis pour évaluer la qualité des extraits commercialisés, critère de choix pour les ingrédientistes ou les formulateurs. La stratégie de l'étude proposée repose sur une complexification progressive des solutions de tanins qui seront analysées. Des solutions modèles judicieusement choisies permettront de produire et d'analyser indépendamment des motifs oxydés représentatifs de motifs oxydés intra-chaînes, des motifs oxydés représentatifs des liaisons inter-chaînes, en s'appuyant sur les résultats de récents travaux réalisés à l'UMR SPO visant à étudier des marqueurs d'oxydation de monomères de flavanols par mobilité ionique [5, 6]. En outre, des cinétiques d'oxydation seront réalisées sur ces solutions et suivies au cours du temps pour obtenir et caractériser les divers degrés d'oxydation. Une fois que les différents types de motifs oxydés auront été bien caractérisés, des solutions modèles réalisées avec des tanins d'origines variées seront analysées.

1- Molécules modèles commerciales
La stratégie de travail vise à analyser progressivement des échantillons de complexité croissante. L'étude commencera par l'analyse de molécules modèles pures, disponibles commercialement. Ces molécules représentent des degrés de polymérisation précis et des compositions en unités connues (Dimère d'épicatéchine B2, Dimère de type A, Trimère d'épicatéchine C1).

2- Fractions de tanins visant à explorer la diversité de ces polymères
L'objet des études qui seront réalisées dans le cadre de la thèse sont les tanins. Les tanins sont des structures polymères hétérogènes pour la plupart et varient en fonction de différents paramètres : espèce végétale, organe, tissu, conditions pédoclimatiques, et stress subis par la plante. Ces composés sont généralement extraits par macération avec des mélanges de solvants hydro-alcooliques ou hydro-acétoniques. Les extraits peuvent être purifiés par une chromatographie flash et récupérés sous forme de fractions qui présentent des caractéristiques différentes, telles que la longueur moyenne des chaînes, ou la composition moyenne des unités. La première partie du travail consistera à, selon les cas, isoler des fractions de tanins à partir de différentes matières premières afin d'explorer au mieux la diversité de ces polymères : homopolymères d'épicatéchine, tanins de type B, tanins de type A, 5-deoxy tanins, tanins contenant une fraction importante d'unités gallo- ou/et gallates de catéchines.

3- Solutions plus ou moins oxydées
L'objectif étant de caractériser l'état d'oxydation des tanins, des solutions de molécules modèles et des solutions de fractions de tanins seront soumises à des réactions d'oxydation (auto-oxydation, oxydation enzymatique ou chimique) afin d'analyser de façon exhaustive les motifs d'oxydation et de les comparer en fonction du type d'oxydation. Les solutions oxydées seront analysées au cours du temps afin de caractériser l'évolution des produits.
Ainsi, les molécules commerciales modèles, les différentes fractions de tanins isolées ou purifiées, et leurs solutions oxydées avec différents types de catalyseurs et des durées plus ou moins longues constitueront un socle d'échantillons essentiels pour développer et optimiser la méthodologie d'analyse ainsi que la méthodologie de retraitement des données. Grâce à la spectrométrie de mobilité ionique TIMS, une séparation des ions fragments isomères est attendue et fournira un paramètre supplémentaire d'identification. Ce paramètre, intrinsèque à la molécule, correspond à la CCS, dont la valeur est mesurée en spectrométrie de mobilité ionique mais peut être également prédite à partir d'une structure modélisée. Ainsi, ce paramètre apportera un degré de confiance supplémentaire dans l'identification des motifs d'oxydation dont la valeur pourra être prédite par des approches de modélisation, menées en parallèle.
L'objectif final est de caractériser l'état d'oxydation des tanins avec des descripteurs quantitatifs et qualitatifs, comme la proportion d'unités oxydées sur le nombre total d'unités, le degré d'oxydation des motifs oxydés (avancement de la réaction d'oxydation), la proportion de motifs oxydés correspondant à de l'oxydation intra-chaîne ou à des réactions inter-chaînes [7], la proportion de motifs correspondant à ces deux caractéristiques ainsi que la nature des unités (bouts de chaînes versus extensions) impliquées dans ces motifs d'oxydation.
Néanmoins, certains de ces descripteurs ont été partiellement caractérisés au laboratoire dans des travaux antérieurs, par l'analyse des solutions après dépolymérisation chimique [1,2]. Les résultats obtenus avec la dépolymérisation en source et ou dans la cellule de mobilité ionique du spectromètre de masse pourront être comparés à ceux des analyses réalisées après dépolymérisation chimique des solutions.
Le TIMS-TOF permet en effet d'accéder à une analyse à haute résolution (HRMS). Ainsi, une étude comparative (de type « métabolomique ciblée ») des motifs d'oxydation présents au sein des structures de tanins évolués obtenus après fragmentation en source pourra également être envisagée sur une série d'échantillons complexes (marcs et vins). Cette étude pourra être réalisée sur la base d'expériences de chromatographie liquide à ultra-haute performance et de spectrométrie de masse à haute résolution acquises précédemment, et grâce à des analyses multivariées et de réseaux moléculaires dont les méthodologies ont été développées par la PFP [6].

Le programme de recherches comporte neuf tâches organisées en 3 volets décrits ci-après :

- Volet 1 : Construction de la base d'échantillons à analyser : (1.1) Isolation de fractions de tanins issus de différentes matrices végétales ; (1.2) Purification de fractions de tanins issus d'extraits/produits commerciaux ; (1.3) Oxydation des fractions en solution, avec 3 types de catalyseurs (métaux, enzyme, oxydant chimique).

- Volet 2 : Développement de la méthodologie d'analyse des échantillons en couplage UHPLC-TIMS-MS : (2.1) A partir de molécules modèles et des fractions de tanins produites ; (2.2) A partir des solutions oxydées et de leurs suivis cinétiques ; (2.3) Application et validation de la méthodologie sur des solutions de complexité croissante.

- Volet 3 : Analyse et interprétation des données : (3.1) Construction d'une bibliothèque d'échantillons et de produits caractérisés ; (3.2) Modélisation des structures par chimie computationnelle et calcul de paramètres (surface de la molécule, moment dipolaire, distribution de la charge sur la surface, conformation de l'ion dans un champ électrique, etc) ; (3.3) Analyse et interprétation sur la base des données expérimentales et des modèles.

- Étudiant(e) ayant un Master 2 en chimie analytique ou chimie organique.
- Bonne maîtrise des techniques de spectrométrie de masse.
- Connaissances de base en chimie des polyphénols.
- Esprit analytique, rigueur scientifique et capacité à interpréter des résultats complexes.

• Esprit d'analyse
• Chimie